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    細(xì)胞凍存保種

    發(fā)布時(shí)間: 2022-10-18  點(diǎn)擊次數(shù): 1309次


    細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)中晚期,以培養(yǎng)基制備高濃度細(xì)胞懸液,加入細(xì)胞保護(hù)劑,等份轉(zhuǎn)移至凍存管中,緩慢冷凍。

    市場上有多家成熟的無血清凍存液,這些試劑簡單實(shí)用,極其便捷。對(duì)一些難復(fù)蘇的細(xì)胞極其友好。但是對(duì)于長期的細(xì)胞留庫保種還是建議采用傳統(tǒng)的方法。

    兩種凍存液比較
    方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)

    傳統(tǒng)DMSO/甘油凍存法  

     能較好的維持細(xì)胞的特性 一些細(xì)胞凍存效果不佳

    無血清無蛋白凍存法

    使用方便,對(duì)新手友善

    同樣含有DMSO,某些敏感細(xì)胞慎用

     


    原理


    傳統(tǒng)上的細(xì)胞凍存(甘油/二甲基亞砜做保護(hù)劑)講求的是:慢凍速溶。細(xì)胞凍存時(shí)向培養(yǎng)基中加入的甘油或二甲基亞砜(DMSO),這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性,加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外,減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。

     


    用途


    細(xì)胞保種


    材料與儀器


    【實(shí)驗(yàn)材料】細(xì)胞、DMSO、0.25% Trypsin-EDTA(或細(xì)胞刮刀)、100 X雙抗、PBS、胎牛血清、DMEM *培養(yǎng)基、75% 乙醇、胰酶、異丙醇;

    【儀器與用品】凍存管、37度恒溫水浴鍋、培養(yǎng)皿(6 cm)、細(xì)胞凍存盒(已添加異丙醇)或凍存泡沫盒、記號(hào)筆、-80度冰箱、倒置相差顯微鏡、凍存管、37度恒溫水浴鍋、培養(yǎng)皿(6cm)、液氮罐、離心機(jī)、細(xì)胞房專用超凈臺(tái)、移液槍及移液槍頭(無菌或滅菌后烘干)、一次性細(xì)胞計(jì)數(shù)板、細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀、培養(yǎng)箱、移液管。


    步驟


     1.  預(yù)先配制凍存液:按正常培養(yǎng)基:DMSO =9:1比列配制凍存液;

    2.  取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,用胰蛋白酶把單層生長的細(xì)胞消化下來,離心1000 rpm,5 min;

    3.  去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液,加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻,計(jì)數(shù),調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×106/mL~1×107/mL;

    4.  將細(xì)胞分裝入凍存管中,每管1~1.5 ml;

    5.  在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱,凍存時(shí)間、細(xì)胞代數(shù)及操作者;

    6.     往凍存盒中加入異丙醇(在負(fù)八十冰箱中能以1℃/min的速度下降)放入負(fù)八十冰箱即可,建議12小時(shí)以上,一般可在負(fù)八十中保存半年至一年,長期保存要轉(zhuǎn)移至液氮中;商用凍存液可以直接凍存管放負(fù)八十冰箱。

     


    注意事項(xiàng)


    1、液氮凍存不建議用國產(chǎn)凍存管,復(fù)蘇時(shí)容易爆管;

    2、消化細(xì)胞時(shí),不能過度消化;

    3、DMSO溶于DMEM培養(yǎng)基會(huì)放熱,應(yīng)提前5-10分鐘配置凍存液。用凍存盒時(shí)避免異丙醇將標(biāo)記擦掉;

    4、二甲基亞砜能穿透許多合成的或天然的膜,包括皮膚和橡膠手套。因此,應(yīng)謹(jǐn)慎處理。將凍存管放入液氮時(shí),必須使用保護(hù)性手套和面罩。


    常見問題


    1、細(xì)胞消化過度,導(dǎo)致復(fù)蘇時(shí)細(xì)胞狀態(tài)不好;

    2、負(fù)八十冰箱中長期保存細(xì)胞效果不好,應(yīng)及時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中;

    3、國產(chǎn)凍存管在液氮中容易漏液氮,導(dǎo)致復(fù)蘇時(shí)曝管,所以放液氮中盡量使用質(zhì)量較好的凍存管。


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