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貼壁細(xì)胞的消化方法
發(fā)布時間: 2022-12-16 點(diǎn)擊次數(shù): 1272次如何消化讓細(xì)胞生長的更好,養(yǎng)細(xì)胞關(guān)鍵還是在消化,以下介紹幾種細(xì)胞的消化方法
一、酶消化法
1、胰酶,這是用得最多的。一般濃度在0.25-0.5%。消化的時間根據(jù)細(xì)胞種類、操作手法,溫度等因素而變化,從幾分鐘到幾十分鐘不等。0.25%的胰酶,37℃一般在消化單層貼壁的細(xì)胞一般1-5分鐘就足夠了,用血清或者含血清的完-全培養(yǎng)基終止。
2、膠原酶,一般用于原代細(xì)胞消化,這種方法作用溫和,對細(xì)胞損傷較小,消化的時間也略長,不推薦的原因是膠原酶有點(diǎn)小貴而且培養(yǎng)細(xì)胞株感覺沒有多大的必要。
二、離子螯合劑
不破壞細(xì)胞表面分子,僅與CAMs螯合,因此,如果檢測細(xì)胞表面分子的話,盡量,甚至是一定不要用酶消化法。
1、EDTA,一般濃度在0.02%左右,使用它來消化細(xì)胞時,注意它能顯著影響pH值,而且在弱堿性條件下才易溶,而且它不能被終和,因此,消化下來的細(xì)胞一定要洗一遍。
三、物理法
直接吹打或用細(xì)胞刮刀,貼壁很牢的細(xì)胞可以使用這個方法,吹打和刮刀都會給細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷,建議不到萬不得已不要使用此法。
四、冷凍法
采用細(xì)胞冷凍后收縮的原理,從而使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上脫落。優(yōu)點(diǎn):對細(xì)胞損傷小,不需要中止或洗細(xì)胞,方便,不需要另外配制消化液。特別適用那些貼壁不是特別緊,又特別嬌氣的細(xì)胞。缺點(diǎn):細(xì)胞常成小片脫落,重新鋪板后細(xì)胞生長會有點(diǎn)聚團(tuán)。常用于間充質(zhì)干細(xì)胞、DC細(xì)胞的消化,具體過程是:1、用較多的4℃的PBS洗滌一遍細(xì)胞,再加入適量的 4℃的PBS,靜置操作臺上,很快細(xì)胞受冷皺縮小片脫落,3、輕輕吹打,細(xì)胞即完-全脫落,4、按一定比例傳代。
細(xì)胞消化難題:
1,成團(tuán)、絮狀:
消化液里加入edta可以減少細(xì)胞成團(tuán)的現(xiàn)象,血清可以終止胰酶的作用,越好的血清使用的效價更高,用胰酶消化后加血清終止,如果消化液中加入了edta的話,就要將消化液倒干凈,如果細(xì)胞貼壁要求不是很嚴(yán)格的話,一般不需要進(jìn)行離心。
比如說4T1細(xì)胞,這種細(xì)胞的貼壁能力天生很強(qiáng),用0.5%胰酶(含0.1%EDTA)一般要消化10~12min。用PBS洗滌時要洗凈殘余的培養(yǎng)基,加入胰酶后在培養(yǎng)箱中消化(避免細(xì)胞室溫下受損以及在此溫度時胰酶活性最-強(qiáng))至細(xì)胞收縮變圓(可顯微鏡下觀察)且有少許細(xì)胞脫落(呈流沙狀),隨后立即棄去胰酶(如果脫落的細(xì)胞很多且需要大量細(xì)胞實(shí)驗(yàn),則不能棄去胰酶),加入培養(yǎng)基輕輕彈散(不能用無血清培養(yǎng)基或者PBS替代,否則細(xì)胞聚集成團(tuán)塊或絮狀)。
也可以用2%利多-卡因消化5-8分鐘,然后再棄去。
消化過度怎么辦?
馬上用培養(yǎng)基中和,收集全部的細(xì)胞到無菌的離心管中800RPM 3分鐘。棄上清,用全培重懸,換新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng),狀態(tài)不好的細(xì)胞在培養(yǎng)的過程中會死亡脫落,在換液的時候可以清除掉。
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