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    T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗

    發(fā)布時間: 2023-01-10  點擊次數(shù): 894次

    原理

    T 細(xì)胞在體外培養(yǎng)時,受到非特異性有絲分裂原(如PHA、ConA)刺激后,可出現(xiàn)細(xì)胞體積增大,代謝旺盛,蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低可以反映機體的細(xì)胞免疫水平,因此可作為測定機體免疫功能的指標(biāo)之一。
    淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗有形態(tài)計數(shù)法、MTT 法和同位素法三種。
    MTT 法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法。MTT 是一種噻唑鹽,化學(xué)名3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑,水溶液為黃橙色。小鼠脾細(xì)胞受到ConA 作用后發(fā)生增殖活化,其胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應(yīng)升高,MTT 作為其底物參與反應(yīng),形成藍(lán)色的甲臜(Formazan)顆粒沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍,經(jīng)鹽酸─異丙醇溶解后為藍(lán)色溶液,可用酶標(biāo)測定儀測定細(xì)胞培養(yǎng)物的OD 值,測定波長570 nm。根據(jù)OD 值的大小計算反應(yīng)體系中細(xì)胞增殖程度。

    3H-TdR 摻入法:細(xì)胞增殖的基本條件或前提為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的復(fù)制,這是正常細(xì)胞增殖過程缺一不可的前提。一般來說,一個細(xì)胞周期可大致分為四期,即G1 期、S期、G2 期和M期。其中S期為DNA合成期,主要功能活動為DNA合成。3H-TdR即(甲基-3H)胸腺嘧啶核苷([3H-methyl]thymidine),是DNA合成的前體。加入細(xì)胞培養(yǎng)液中后被細(xì)胞攝取作為DNA合成的原料。細(xì)胞合成的DNA越多,則所摻入的3H-TdR就越多,因此,檢測所摻入的3H-TdR就可反映細(xì)胞增殖的程度。因該方法有同位素污染問題,故我們實習(xí)中仍用MTT法。

    材料與儀器

    ICR小鼠
    RPMI1640培養(yǎng)液 Hank's液 刀豆蛋白A MTT 碘酒 酒精
    無菌尖吸管 刻度吸量管 無菌解剖器械 平底培養(yǎng)板 CO2培養(yǎng)箱 酶標(biāo)測定儀

    步驟

    1.  小鼠脾細(xì)胞懸液的制備
    取一個滅菌的平皿,加入5 ml Hank's液。頸椎脫臼法處死小鼠,取脾臟,放入平皿中,在鋼網(wǎng)上研磨并過篩,制成細(xì)胞懸液。取出100 μl用于計數(shù)。將其余細(xì)胞懸液移入一離心管中,離心1500 rpm,7 min,(或1000 rpm,10  min)棄去上清,用RPMI1640 培養(yǎng)液稀釋,制成2.5×106 /ml的脾細(xì)胞懸液,然后加入ConA使每孔最終濃度為2 μg/ml,同時做不加ConA的陰性對照孔。
    2.  將上述細(xì)胞懸液加入96孔平底培養(yǎng)板中,每孔0.1 ml。
    3.  將培養(yǎng)板放入含有5 %CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72 小時,在培養(yǎng)結(jié)束前4-6 小時,于培養(yǎng)板各孔內(nèi)加入1 mg/mlMTT液,10 μl/孔。37 ℃培養(yǎng)6 小時。
    4.  各孔內(nèi)加入0.01 M 鹽酸—異丙醇110 μl,30 分鐘內(nèi)(或加2 %SDS100 ul/孔,過夜)用酶標(biāo)測定儀測OD 值,測定波長570 nm。

    注意事項

    1.  由于本實驗需要培養(yǎng)3 天,才能觀察結(jié)果。因此,在操作時應(yīng)注意無菌操作,避免細(xì)菌污染,導(dǎo)致實驗的失敗。
    2.  細(xì)胞操作要輕柔、迅速,以免細(xì)胞損傷影響實驗結(jié)果。





    常見問題

    一、實驗結(jié)果

    將實驗組和對照組三個復(fù)孔的 OD 值平均。

    轉(zhuǎn)化值=實驗組的平均OD 值-對照組的平均OD 值。


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