原代細(xì)胞的培養(yǎng)與建系

凡是來(lái)源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來(lái)的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。細(xì)胞的純化或細(xì)胞克隆技術(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)工作的基礎(chǔ)。

原代細(xì)胞的取材

人和動(dòng)物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件，直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)。

一、取材的基本要求

.1．取材要注意新鮮和保鮮

.2．應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌

.3．防止機(jī)械損傷

.4．去除無(wú)用組織和避免干燥

.5．應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等

.6．作好記錄

二、各類組織的取材技術(shù)

皮膚和粘膜的取材

內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材

血液細(xì)胞的取材

骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材

動(dòng)物組織取材

人胚體組織取材

雞（鴨）鳥(niǎo)類胚胎組織取材雞（鴨）鳥(niǎo)類胚胎組織取材

皮膚和粘膜的取材

主要取自于手術(shù)過(guò)程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積一般 2~4 平方厘米。

內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材

內(nèi)臟除消化道外基本是無(wú)菌的，但取材時(shí)要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實(shí)體瘤取材時(shí)要取腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域，要避開(kāi)破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締織。

血液細(xì)胞的取材

血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、

淋巴結(jié)等）分離細(xì)胞，取材時(shí)應(yīng)注意抗凝。

骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材

嚴(yán)格無(wú)菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，用無(wú)鈣、鎂 PBS 洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。

動(dòng)物組織取材

1、鼠胚組織取材

首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動(dòng)物，然后將其整個(gè)浸泡在含有 75%酒精的燒杯中，5 分鐘后（注意時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內(nèi)，影響組織活力），取出動(dòng)物，在消毒過(guò)的木板上可用無(wú)菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開(kāi)皮膚，用無(wú)菌操作法解剖取胚或用無(wú)菌止血鉗挾起皮膚、用無(wú)菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開(kāi)皮膚，用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾，把動(dòng)物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無(wú)菌解剖器材，采用無(wú)菌操作法解剖取出胚胎。

2、幼鼠胚腎（或肺）取材

幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開(kāi)游離毛皮并拉開(kāi)至兩側(cè)：然后采用無(wú)菌法打開(kāi)胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開(kāi)游離并拉向兩側(cè)，然后采用無(wú)菌法從背部打開(kāi)腹腔取腎。

人胚體組織取材

取材方法與鼠類相同

雞（鴨）鳥(niǎo)類胚胎組織取材步驟

（1）取孵化至適當(dāng)胚齡（9~12 天）的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運(yùn)動(dòng)的胚蛋，說(shuō)明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。

（2）將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用 75%酒精棉球擦干；

（3）經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無(wú)菌條件下采用無(wú)菌法用剪刀或中號(hào)鑷子打開(kāi)氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼；

（4）用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚；

（5）用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無(wú)菌平皿中，解剖取材。

原代細(xì)胞的分離和制作

人或動(dòng)物體內(nèi)（或胚胎組織）由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長(zhǎng)繁

殖，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開(kāi)，使細(xì)胞解離出來(lái)。

一、懸浮細(xì)胞的分離方法

組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，用簡(jiǎn)單的方法是采用 1000r/min 的低速離心 10 分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。

二、實(shí)體組織材料的分離方法

對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。

（一）機(jī)械分散法

方法:特點(diǎn):簡(jiǎn)便、快速,但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差,適用于處理纖維成分少

的軟組織。

（二）消化分離法

組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。

1．酶消化分離法

酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶

胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一種胰臟制品，對(duì)蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開(kāi)。

影響胰蛋白酶作用的主要因素

細(xì)胞類型.酶的活力.酶的濃度.溫度.pH .無(wú)機(jī)鹽離子.消化時(shí)間

膠原酶（Collagenase）消化法

膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來(lái)的酶，對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用。

2．非酶消化法（EDTA 消化法）

EDTA 是一種非酶消化物，又稱螯合劑或 Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的 PBS 配成 0.02%的工作液，對(duì)一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離。

3．消化分離法的操作步驟

剪切.加液漂洗.消化.棄去消化液.漂洗.機(jī)械分散

4．消化分離法的注意事項(xiàng)

（1）組織塊必須漂洗 2-3 次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對(duì)胰蛋白酶和 EDTA 的抑制作用。

（2）胰蛋白濃度不宜過(guò)高，作用時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免毒性作用。

（3）消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。

三、原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法

原代細(xì)胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)是從供體取得組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的初次培養(yǎng)，是建立細(xì)胞系的第一步，是一項(xiàng)基本技術(shù)。原代細(xì)胞較為接近和最能反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性，適宜用于藥物敏感性試驗(yàn)、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。

（一）組織塊培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。其基本方法是將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長(zhǎng)。

（二）消化培養(yǎng)法

（三）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法

對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無(wú)需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。

（四）器官培養(yǎng)

器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對(duì)完整性，可用于重點(diǎn)觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。

原代和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)和維持

原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持

原代細(xì)胞培養(yǎng)的初次傳代

傳代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

傳代細(xì)胞的建系和維持

一、原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持

(一)原代細(xì)胞培養(yǎng)：

1．靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))培養(yǎng)

2．懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)

靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))培養(yǎng)要求

細(xì)胞要通過(guò)充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性；

細(xì)胞接種時(shí)濃度要稍大一些，至少為 5×108 細(xì)胞/L；

培養(yǎng)基可用 Eagle(MEM)或 DNEM 培養(yǎng)；

小牛血清濃度為 10%-80%；

應(yīng)在 37℃5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

在起始的 2 天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落，漂浮；

待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應(yīng)將原代細(xì)胞換液；

用骨髓或外周血中的懸浮細(xì)胞經(jīng)靜置培養(yǎng) 1 周時(shí)，應(yīng)將細(xì)胞懸液經(jīng)低速離心后換液；

懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)要求原代培養(yǎng)時(shí)要盡量去除紅細(xì)胞；

短期培養(yǎng)，可在含 10%小牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基中進(jìn)行；

細(xì)胞濃度可在 5-8×109/L 范圍內(nèi)，.進(jìn)行分瓶試驗(yàn)；

長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)，淋巴細(xì)胞中要加入生長(zhǎng)因子，白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì)

胞生長(zhǎng)；

細(xì)胞換液一般每隔 3 天需半量換液一次；

細(xì)胞傳代一般待細(xì)胞增殖加快、細(xì)胞密度較高時(shí)才能進(jìn)行；

(二)原代細(xì)胞的維持

貼壁細(xì)胞長(zhǎng)成網(wǎng)狀或基本單層時(shí)，未達(dá)到飽和密度，需采取換液方式來(lái)更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分以滿足

細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖的需要；

換入等量*培養(yǎng)基或換成含 2%小牛血清的維持液；

懸浮細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基中不僅會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會(huì)發(fā)生分裂繁殖，此時(shí)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分并不

能維持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求，需進(jìn)行換液。通常采用半量換液的方法；

二、原代細(xì)胞培養(yǎng)的初次傳代

原代培養(yǎng)后由于懸浮細(xì)胞增殖，數(shù)量增加甚至達(dá)飽和密度；貼壁細(xì)胞的相互匯合，使整個(gè)瓶

底逐漸被細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞難以繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，需要進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，這種使原代細(xì)胞經(jīng)分散接

種的過(guò)程稱之為傳代。

初次傳代應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

(1)細(xì)胞生長(zhǎng)密度不高時(shí)，不能急于傳代。

(2)原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時(shí)間。

(3)吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機(jī)械損傷。

(4)初次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些。

(5)初次傳代培養(yǎng)的 pH 應(yīng)偏低些。小牛血清濃度可加大至 15%～20%左右

三、傳代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

傳代細(xì)胞，可根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法進(jìn)行細(xì)胞傳代。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代，部分貼壁的細(xì)胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細(xì)胞可采用加入等量新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散進(jìn)行傳代，或用自然沉降法加入新培養(yǎng)基后再吹打分散進(jìn)行傳代。

貼壁細(xì)胞的消化傳代步驟

(1)吸除或倒掉原瓶中的舊培養(yǎng)基（以 25mL 培養(yǎng)瓶為例）。

(2)每瓶加入 2mL，無(wú)鈣、鎂 PBS，漂洗一次后倒掉。

(3)每瓶加入 1mL 消化液（0.25%胰蛋白酶或 0.02%EDTA 或混合液），輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，經(jīng)消化液鋪滿所有細(xì)胞表面，待細(xì)胞層略有松動(dòng)，肉眼可觀察到“薄膜”現(xiàn)象時(shí)，倒掉消化液，再繼續(xù)作用 2～3 分鐘，輕輕搖動(dòng)，細(xì)胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來(lái)，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大，此時(shí)應(yīng)立即終止消化。

(4)加入*培養(yǎng)基 5mL，用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，吹打時(shí)要按順序進(jìn)行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要用力過(guò)大，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，以避免細(xì)胞的機(jī)械損傷。

(5)用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的濃度，并用培養(yǎng)基調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)。

四、傳代細(xì)胞的建系和維持

細(xì)胞系的維持通過(guò)換液傳代再換液、再傳代和細(xì)胞種子凍存來(lái)實(shí)現(xiàn)；

對(duì)每一個(gè)細(xì)胞系來(lái)說(shuō)都有其自身的特點(diǎn)，要做好建系的維持必須記錄好細(xì)胞檔案,換液傳代和做好細(xì)胞系（或株）的鑒定和管理工作；

原代細(xì)胞的純化和克隆

體外培養(yǎng)的細(xì)胞絕大多數(shù)都呈混合生長(zhǎng)，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、一致性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，要求采用單一種類細(xì)胞來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因而培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為實(shí)驗(yàn)研究的重要一步。

一、細(xì)胞的純化

細(xì)胞的純化分為(一)自然純化：長(zhǎng)期傳代過(guò)程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長(zhǎng)慢的細(xì)胞，最后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)旺的細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。如腫瘤突變細(xì)胞通過(guò)此方法建立細(xì)胞系。

(二)人工純化：利用人為手段造成某一細(xì)胞生長(zhǎng)有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長(zhǎng)從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的。主要有以下 5 種方法。

1．細(xì)胞因子依賴純化法：通過(guò)加入某些特殊的細(xì)胞因子而純化出只依賴于這種細(xì)胞因子生長(zhǎng)的細(xì)胞系。

2．酶消化法：利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同，使兩者分開(kāi)，達(dá)到純化的目的。另外對(duì)貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的。

（1）上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的分離純化

兩者在胰蛋白酶的作用下，由于成纖維細(xì)胞先脫壁，而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間才脫壁，特別是在原代細(xì)胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯，故可采用多次差別消化方法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開(kāi)，

（2）骨髓基質(zhì)肌樣細(xì)胞的純化

在血液細(xì)胞和骨髓細(xì)胞靜置培養(yǎng)時(shí)，常有許多肌樣細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，但也有許多淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞粘附其上，種類混雜，鑒于粘附細(xì)胞貼壁不牢固，也可用酶消化法使粘附細(xì)胞脫壁分離，以達(dá)到骨髓基質(zhì)細(xì)胞或血液中肌樣細(xì)胞與淋巴細(xì)胞分開(kāi)和純化的目的。

3．機(jī)械刮除法

原代培養(yǎng)時(shí),如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為分區(qū)成片混雜生長(zhǎng)，每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長(zhǎng)在瓶壁上?？刹捎脵C(jī)械的方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要的細(xì)胞區(qū)域;

4．反復(fù)貼壁法

成纖維細(xì)胞其貼壁過(guò)程快，能在短時(shí)間內(nèi)完成附著過(guò)程，而上皮細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細(xì)胞。

5．電烙篩選法

在貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，在培養(yǎng)瓶的細(xì)胞層中會(huì)出現(xiàn)分散的轉(zhuǎn)化灶，細(xì)胞密集、排列規(guī)則，有明顯生長(zhǎng)趨勢(shì)，與周邊未能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有明顯的區(qū)域界限，可用機(jī)械刮除法去除或用電烙篩選法燙死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞而保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞。

二、細(xì)胞的克隆化

細(xì)胞克隆技術(shù)又稱單個(gè)細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)，即從細(xì)胞群體中分離出一個(gè)細(xì)胞，并使其在體外培養(yǎng)體系中能繁殖成新的細(xì)胞群體，這種由單個(gè)細(xì)胞所形成的細(xì)胞群（或集落）稱為一個(gè)克隆，這種純化后的細(xì)胞群體稱為細(xì)胞株。

主要的克隆方法有 5 種

（一）毛細(xì)管克隆法

（二）有限稀釋克隆法

（三）平皿克隆分離法

（四）軟瓊脂克隆分離法

（五）單細(xì)胞顯微克隆法

毛細(xì)管克隆法：

（1）將一定量的細(xì)胞懸液（如 105/mL 或更低）稀釋至 1 個(gè)細(xì)胞/mL；

（2）取 10mL 稀釋的細(xì)胞懸液，用直徑為 0.5mm，長(zhǎng)為 8mm 的毛細(xì)玻璃管若干（30～50 只），在負(fù)壓作用下，使懸液吸入各毛細(xì)管中；（3）在倒鏡下檢查出每管只進(jìn)入一個(gè)細(xì)胞的毛細(xì)管，然后放入適應(yīng)性培養(yǎng)基或有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（或培養(yǎng)板）內(nèi)；

（4）在 CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由一個(gè)細(xì)胞在毛細(xì)管繁殖后，并向管外擴(kuò)展，并形成單個(gè)克隆的細(xì)胞群體。

有限稀釋克隆法：

(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成懸液(貼壁細(xì)胞用 0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，經(jīng)臺(tái)

盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，測(cè)定活細(xì)胞數(shù)及濃度（細(xì)胞存活率及單個(gè)細(xì)胞百分率應(yīng)高于 90%以上）。

（2）將細(xì)胞懸液在試管中稀釋，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至 50 個(gè)細(xì)胞/mL、10 個(gè)細(xì)胞/mL、5

個(gè)細(xì)胞/mL，將 3 種稀釋度的細(xì)胞分別接種于 96 孔板中，每孔為 0.1mL，于 37℃5%CO2

下培養(yǎng)。

（3）次日在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)板各孔中的細(xì)胞數(shù)，挑選只含一個(gè)細(xì)胞的孔，做好標(biāo)記

并補(bǔ)加 0.1mL 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

（4）培養(yǎng)期間，視 pH 值的變化決定是否換液或補(bǔ)加培養(yǎng)液，一周左右，孔中有明顯克隆

出現(xiàn)。

（5）待克隆長(zhǎng)至孔底面的 1/3～1/2 時(shí)，可用消化法將 96 孔中的單一克隆的細(xì)胞分別移至

24 孔板中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

平皿克隆分離法：

(1)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備單個(gè)細(xì)胞懸液（懸浮細(xì)胞用吸管吹打分散，貼壁細(xì)胞先用 0.25%

胰蛋白酶消化后，再用培養(yǎng)基吹打分散）計(jì)數(shù)并用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，使 5mL 培養(yǎng)液內(nèi)

含有 50～200 個(gè)細(xì)胞（細(xì)胞存活率及單個(gè)細(xì)胞百分率應(yīng)大于 90%以上）。

(2)將上述細(xì)胞懸液迅速移入 60mm 平皿中，在 37℃5% CO2 下培養(yǎng) 1 周或更長(zhǎng)。若有明

顯的克隆形成時(shí)方可進(jìn)行克隆分離，方法有兩種：①套環(huán)法：在倒置顯微鏡下觀察克隆形成的情況，標(biāo)記單個(gè)克隆周邊，吸干培養(yǎng)基，用涂有

少量無(wú)菌硅脂的無(wú)菌金屬套環(huán)，套住標(biāo)記的克隆，在套環(huán)內(nèi)滴加少量 0.25%胰蛋白酶，待

細(xì)胞脫離時(shí)，用注射器針頭輕輕吹打分散后，轉(zhuǎn)入小平皿或 24 孔板或 6 孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。

②玻片法：在接種細(xì)胞懸液前，預(yù)先在 60mm 平皿中放入無(wú)菌小玻片，加入細(xì)胞懸液，培

養(yǎng)一定時(shí)間后，在倒置顯微鏡下標(biāo)記上含一個(gè)克隆的玻片，然后用無(wú)菌鑷子取出標(biāo)記玻片轉(zhuǎn)

入 24 孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。

軟瓊脂克隆分離法：

(1)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單個(gè)細(xì)胞懸液?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞)作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至 1×106

細(xì)胞/L，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求再作梯倍稀釋。通常以 1~5×104 個(gè)細(xì)胞/L 為佳。

(2)制備底層瓊脂取 5%瓊脂置沸水中，使瓊脂*溶化，取出一份 5%瓊脂，移入小燒杯中，

待冷至 50℃，迅速加入 9 份預(yù)溫 37℃的新鮮培養(yǎng)液（即成為 0.5%瓊脂），混勻后立即注入

24 孔培養(yǎng)板中，每孔含 0.5% 瓊脂 0.8mL，置室溫使瓊脂凝固備用（此層也可以省略）。

(3)制備上層瓊脂取 37℃保溫的、不同濃度的細(xì)胞懸液 9.4mL，移入小燒杯中，加入 50℃

5% 瓊脂 0.6mL 迅速混勻，即配成 0.3%瓊脂培養(yǎng)基，立即澆入鋪有底層瓊脂的 24 孔培養(yǎng)

板中，每孔 0.8ml，置室溫使瓊脂凝固。

(4)于 37℃5% CO2 下培養(yǎng) 1~2 周或更長(zhǎng)，若需培養(yǎng)更長(zhǎng)時(shí)間可補(bǔ)加 0.8mL/孔含瓊脂的培

養(yǎng)液，待有明顯集落形成為止。

(5)集落（克?。┯?jì)數(shù)在倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)直徑大于 75μm 或含有 50 個(gè)細(xì)胞以上的

克隆。

生成克隆數(shù)集落(克隆)形成率(%)= ————————×100%

每皿接種細(xì)胞數(shù) 單個(gè)細(xì)胞的數(shù)目

單個(gè)細(xì)胞百分率(%) = ———————————————×100%單個(gè)細(xì)胞數(shù)目+2 個(gè)以上細(xì)胞群數(shù)目

單細(xì)胞顯微克隆法：

是借助顯微操縱器，在顯微鏡監(jiān)控下將單個(gè)細(xì)胞逐個(gè)吸出，移入含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板中

進(jìn)行培養(yǎng)克隆的方法。

（1）飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備：

①用 0.25%胰蛋白酶消化單層貼壁生長(zhǎng)的 3T3 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為 108 細(xì)胞/L，在 96

孔板中每孔加入 0.1mL 細(xì)胞懸液于 37℃5% CO2 中培養(yǎng)至單層。

②將已形成單層的 3T3 細(xì)胞板，用 60Co γ線以 4000～6000 拉得輻射（終濃度為 10-6mol/L）作用 16h。其目的是使細(xì)胞有絲分裂能力喪失，但仍可短期存活，有代謝功能，不僅可維持 pH 而且還可為克隆細(xì)胞提供必要的養(yǎng)分及刺激生長(zhǎng)的因子。

(2)制備單個(gè)細(xì)胞懸液方法同上。

(3)分離單個(gè)細(xì)胞方法多樣，如：

①毛細(xì)管吸入法同上述毛細(xì)管法，在顯微鏡下將只有一個(gè)細(xì)胞的毛細(xì)管取出。

②微滴法將經(jīng)稀釋至 103 個(gè)細(xì)胞/L 的單個(gè)細(xì)胞懸液，用無(wú)菌的 1mL 注射器逐滴加在平皿中

制成散滴，在顯微鏡下挑選出單個(gè)細(xì)胞的液滴，再用毛細(xì)管取出單個(gè)細(xì)胞懸滴。

③液體石蠟法將經(jīng)稀釋至 103 個(gè)細(xì)胞/L 的單個(gè)細(xì)胞懸液，用無(wú)菌的 1mL 注射器逐滴加入充

滿無(wú)菌液體石蠟的平皿底部，在倒置顯微鏡下挑選只有一個(gè)細(xì)胞液滴，仔細(xì)用毛細(xì)吸管取出

有一個(gè)細(xì)胞的液滴。

④玻璃小球附著法將稀釋至 103 個(gè)細(xì)胞/L 的細(xì)胞懸液加入表面涂有無(wú)菌凡士林石蠟的小玻

璃珠的平皿中，混勻后，在倒置顯微鏡下挑選玻璃珠表面只粘附一個(gè)細(xì)胞的玻珠，仔細(xì)用鑷

子取出。(4)將采用上述方法分離出的單個(gè)細(xì)胞，放入預(yù)先制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的 96 孔培養(yǎng)板中，于 37℃

5% CO2 下培養(yǎng) 1~2 周或更長(zhǎng)。

(5)待細(xì)胞克隆明顯，并使孔底覆蓋 1/3～1/2 時(shí)，即可將細(xì)胞轉(zhuǎn)種于 24 孔板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)

（貼壁細(xì)胞仍需用 0.25%胰酶消化法取出轉(zhuǎn)種）。人或動(dòng)物體內(nèi)(或胚胎組織)由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長(zhǎng)繁殖，

即使采用 1mm3 的組織塊，也只有少量處于周邊的細(xì)胞可能生存和生長(zhǎng)，若需獲取大量細(xì)

胞，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開(kāi)，使細(xì)胞解離出來(lái)，常采用的方法如下：

一、懸浮細(xì)胞的分離方法

組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，較為簡(jiǎn)單的方法是采用 1000r/min 的

低速離心 10 分鐘，若懸液量大，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間，但速度不能太高，延時(shí)也不能太長(zhǎng)，

以避免擠壓或機(jī)械損傷細(xì)胞，離心沉淀用無(wú)鈣、鎂 PBS 洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，調(diào)整

適當(dāng)細(xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)，若選用懸液中某些細(xì)胞，常采用離心后的細(xì)胞分層液，因?yàn)椋?/div>