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如何從肝臟組織中制備細(xì)胞核?
發(fā)布時(shí)間: 2021-11-17 點(diǎn)擊次數(shù): 1304次材料與儀器
大鼠
裂解緩沖液 濃蔗糖溶液
超速離心機(jī) 組織研磨器步驟
1. 配制裂解緩沖液和濃蔗糖溶液(PMSF 在使用前添加),冰上放置。
裂解緩沖液:
0.25 mol/L 蔗糖網(wǎng)織紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(RSB)
0.25 mol/L 蔗糖(超級(jí)純)
10 mmol/ Tris-HCl (pH7.4)
10 mmol/L NaCl
3 mmol/L MgCl2
1 mmol/L DTT
0.5 mmol/L PMSF ( 用前從溶于乙醇的 100 mmol/L 貯存液中添加)
濃蔗糖溶液:
2 mol/L 蔗糖 RSB
2 mol/L 蔗糖(超級(jí)純)
10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)
10 mmol/L NaCl
3 mmol/L MgCl2
1 mmol/L DTT
0.5 mmol/L PMSF(用前從溶于乙醇的 100 mmol/L 貯存液中添加)
2. 超速離心機(jī)(Beckman 的與 SW28 轉(zhuǎn)頭兼容型)和轉(zhuǎn)頭預(yù)冷到 4℃。
3. 將組織研磨器(55 ml 的研磨腔; Thomas C 型腔和鋸齒型 Teflon 研杵,3431-E25)。量筒和燒杯放到冰上。
4. 在一冰桶的冰上放一玻璃盤(pán)。
5. 處死大鼠,取出肝臟,稱重。
6. 在一玻璃盤(pán)上,用剃刀片快速去除結(jié)締組織,將 20 g 肝臟切成大約 1cm3 的小塊。
7. 將肝臟碎塊裝入含 40 ml ( 兩倍體積)裂解緩沖液的冷的燒杯中。
8. 將大約 30 ml 這種肝臟碎塊和緩沖液混合物倒入預(yù)冷的組織研磨器腔中。
9. 將研杵連到推進(jìn)器,便其滑到研磨腔中,直到觸到緩沖液面。然后握住研磨腔側(cè)面,打開(kāi)推進(jìn)器。逐漸加大推進(jìn)器速度直至其最高速度,同時(shí)穩(wěn)定地將研磨腔沿轉(zhuǎn)動(dòng)的研磨向上推進(jìn)。當(dāng)研杵到達(dá)研磨腔底部時(shí),向下拉研磨腔直到所有勻漿都從研杵旁通過(guò),然后再將研磨腔沿研杵推回。重復(fù)該過(guò)程 5~10 次后關(guān)掉推進(jìn)器。
10. 檢查細(xì)胞的裂解效率:
(1) 將研磨腔放到冰上,取出 10 μl 裂解液,用 1 ml 裂解緩沖液稀釋。
(2) 取 2.7 μl 稀釋后的裂解液加到載玻片上,再加上 2.7 μl 含 10 μg/ml Hoechst 染料(33258 10 mg/ml;Molecular Probes 或其他供應(yīng)商)的裂解緩沖液,然后用一 18 mm2 的 1 號(hào)蓋玻片將液滴蓋上。
(3) 比較亮的 DNA 染色的細(xì)胞核與同一視野的相圖。
(4) 如果裂解細(xì)胞數(shù)少于 95%,加大推進(jìn)器速度,繼續(xù)研磨樣品 5~10 次。
11. 在一漏斗中裝入 4 層粗孔濾紙,放到一埋在冰浴中的量筒中,然后將勻漿倒進(jìn)漏斗。
12. 裂解剩余的肝臟碎塊,勻漿通過(guò)濾紙過(guò)濾與其余裂解物樣品混和,記錄得到的裂解物體積。
13. 將裂解物體積除以 6,再?gòu)碾x心管體積(35~38 ml) 中減去該體積。即可確定加入 6 個(gè)離心管中的濃蔗糖溶液的體積。在 2 mol/L RSB 溶液中加 PMSF 至終濃度為 0.5 mmol/Lol/L。取適當(dāng)體積(通常為 25~30 ml ) 加到離心管中,冰上放置。
14. 向離心管中加入濃蔗糖溶液和等體積裂解物(通常 7~9 ml )。加裂解物時(shí),應(yīng)將移液管頭靠在離心管內(nèi)壁上部使裂解物緩慢流下,這樣可減少裂解物與蔗糖溶液的混和。
15. 將離心管放到預(yù)冷的轉(zhuǎn)桶中,對(duì)面的轉(zhuǎn)桶用裂解緩沖液平衡。
16. 轉(zhuǎn)桶在 SW28 轉(zhuǎn)頭上裝好,放進(jìn)預(yù)冷的離心機(jī)中,23000 g,4℃ 離心 30 分鐘。
17. 吸出裂解物和蔗糖溶液,或者在一燒杯上將離心管倒轉(zhuǎn)將液體倒出。用一無(wú)絨紙巾清除內(nèi)壁上的殘余物質(zhì),離心管放置于冰上。每管加入 2 ml 裂解緩沖液重新懸浮沉淀。
18. 將沉淀的重懸浮液集中到一個(gè) 50 ml 的離心管(錐形或圓形底)中,加裂解緩沖液至 50 ml 終體積,在醫(yī)用離心管中 1500 g 離心 5 分鐘。
19. 吸出上清,細(xì)胞核沉淀重懸浮于 1 ml 的裂解緩沖液中。取出少量樣品稀釋 100 倍后在血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)細(xì)胞核數(shù)目。
20. 用裂解緩沖液將樣品稀釋到期望濃度的兩倍,加入等體積甘油,放液氮中冷凍,-80℃ 保存。
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