一、細胞誘導前可使用多聚賴氨酸溶液進行細胞包被，以便細胞更好的進行貼壁。
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誘導與檢測方法
發(fā)布時間： 2022-02-28 點擊次數(shù)： 1468次同學A：
使用細胞細胞包被液包被細胞培養(yǎng)板，將傳代或復蘇凍存的人間充質干細胞接種到6孔板上，密度為2×105 -3×105 cells/cm2或2×105 -3×105 cells/孔，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞匯合度達到80%-90%時，小心的將孔內間充質干細胞培養(yǎng)基吸掉，向6孔板中加入2mL人間充質干細胞脂肪分化培養(yǎng)基（此套裝包含基礎500ml，脂肪細胞分化因子：5ml,干細胞生長維持因子：5ml,胎牛血清：25ml ),以此記為第0天。
二、每隔1-2天更換新鮮的人間充質干細胞脂肪分化培養(yǎng)基；
注意：為防止脂肪細胞脫落，建議誘導過程中出現(xiàn)大量脂肪細胞結節(jié)之后，換液形式變?yōu)槊刻煲淮伟肓繐Q液。
三、 誘導14-21天期間，視細胞的形態(tài)變化及生長情況進行染色。
? 以下是總結的染色方法
脂肪油紅染色，有的是動物/人體脂肪組織切片，或細胞爬片。各有操作稍有差異。
一
*成熟飽滿的脂肪細胞，容易破裂，脂滴泄漏，所以壓片，切片都要考慮到這個問題。
二
細胞爬片細胞溶液脫落，特別是脂滴大的。操作務必要輕柔。不要把細胞沖掉。
三
如果做脂肪組織冰凍切片，冰凍切片要適當厚一些，一般為10-15µm，切片太薄容易導致脂肪流失
四
如果培養(yǎng)載體為塑料制品，hoechst33342染核的話，塑料板自發(fā)熒光也為藍色，必須考慮波長，激發(fā)波長/發(fā)射波長=485nm/572nm
誘導的小鼠MMSC-BM的成脂肪細胞
五
染色步驟：
（1） 先小心輕緩倒去培養(yǎng)液。
（2） 用pbs輕緩漂洗。
（3）加10%中性甲醛或者95%以上的酒精固定30min以上
（4） 稀釋改良型即用油紅染色試劑盒，油紅：PBS＝3:2，室溫放置10min
（5）染色10-20min左右，加的體積覆蓋住板底即可，如6孔加1.5ml，24孔加0.5-1ml。
（6）脫色，用75%酒精/60%異丙醇漂洗，除去多余的染料（7） 復染，淡蘇木染色1/5分鐘，pbs漂洗（這一步不做也可，看試驗需要，并且蘇木素會把胞漿染紅，如要顯示核， hoechst33342也可以，濃度5微克/毫升染10分鐘即可把核染上）。
（8）甘油明膠封片（封片后可長期保存）。（9） 若不用明膠封片，請盡快拍照。
同學B：
油紅O染色試劑盒在傳代培養(yǎng)中，接種密度是影響體外培養(yǎng)間質干細胞增殖潛能的重要因素。低密度接種時，間質干細胞的增殖能力明顯提高，而誘導細胞分化時則需要較高的細胞密度，這可能與分化時細胞與細胞間的相互作用有關。而在培養(yǎng)過程中，若細胞過度融合會促進其分化趨向，故要保持干細胞未分化狀態(tài)，要及時傳代。
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