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    Biozellen基質膠在小鼠皮下成瘤實驗的使用步驟

    發(fā)布時間: 2022-08-10  點擊次數(shù): 1524次

    小鼠皮下成瘤、小鼠皮下血管生成實驗準備程序 


    A、細胞房內材料準備、試劑制備及步驟 

    (1) 材料準備: 

    1. 冰盒、2. 37 ℃ 水浴槽、3. C 緩沖溶液(10X)、4. 含15-20%血清細胞培養(yǎng)液 (例如: 含15-20%血清的 DMEM,DMEM-F12等,不可用 PBS )、5. A 膠 (2X)、6. 細胞培養(yǎng)液、7. 23-26G 針頭、8. 1 mL 針筒、9. 細胞。


    (2) 試劑制備: 

    1、C 緩沖溶液 (0.5 X) 制備 : 使用 37 ℃ 水浴回溫含15-20%血清的細胞培養(yǎng)液 (例如: 含15-20%血清 的DMEM 或DMEM-F12 等,不可用 PBS ) 稀釋 C 緩沖溶液 (10 X) 至 C 緩沖溶液 (0.5 X), 即體積稀釋 20 倍。使用前放置 37 度水浴槽。(例如:1 mL C 緩沖溶液 (10 X) + 19 ml 含血清 的DMEM; 若未使用完 畢,可先保存于4 ℃ 冰箱, 保存一周) 

    (注1 :若為小鼠皮下血管生成實驗,制備C緩沖溶液 (0.5 X)時可加入1500 μM Hearin以及60 μg/ml VEGF。) 

    2、A膠 (1X) 制備 : 將 A膠 (2X) (貨號:B--00002-A) 置于37 ℃ 水浴槽回溫10分鐘,確認*溶解。再 將 37 ℃ 水浴回溫的含15-20%血清的細胞培養(yǎng)液取 0.5 mL,加至 37 ℃ 已溶解的 0.5 mL A膠 (2X), 配置成 1 mL 的 A膠 (1X)。使用前置于37度,可降低黏度。 (單次使用,勿重復冷凍解凍 A膠 (1X) ) 


    (3) 步驟: 

    1、取細胞溶液離心后收集細胞沉淀,與C緩沖溶液 (0.5 X) 均勻混合使細胞濃度為3*106-7 cells/mL。

    2、A膠 (1X) 與步驟 1 含 C緩沖溶液 (0.5 X) 的細胞系懸浮液,按照 2:1 比例均勻混合配置,細胞懸浮液 最終濃度為 106-7 cells/mL。使用前置于37℃,可降低黏度。 (C緩沖溶液用于A膠凝膠反應,例如0.5ml C 緩沖溶液(0.5 X)含細胞 加入 1ml A膠 (1X) 混合成1.5ml 的注射液) 

    (注2 :若為小鼠皮下血管生成實驗,可將1500 μM Hearin 以及60 μg/ml VEGF加入C緩沖溶液 (0.5 X),待A膠 (1X) 與含C緩沖溶液 (0.5 X) 的癌細胞懸浮液,依2:1 比例均勻混合后,使Hearin及VEGF最終濃度為:500 μM Hearin以 及20 μg/ml VEGF) 

    3、選用 23-26 G 的針頭 (建議選用 24 G) 及 1 mL 針筒,抽取 步驟2 A膠與 C緩沖溶液的細胞混合液至所 需注射體積 (例如:0.2-0.6 mL) 。室溫37℃至20℃操作抽取。 (若抽取時發(fā)生塞針狀態(tài),可先把針頭拔掉, 以針筒進行抽取,建議一次抽取配置好所需針筒數(shù)量,避免步驟2 溶液過度凝膠,發(fā)生塞針)

    4、將抽取好步驟 3 的針筒,帶入動物房, 若短時間無法施打建議置于冰上。 



    B、動物房內材料準備及步驟

    (1)材料準備: 

    1. 含 A膠與 C緩沖溶液的細胞混合液的針筒、2. 皮膚消毒劑 (例如 : 酒精)、 3. 手套、4. 實驗小鼠、5. 麻醉小鼠的試劑


    (2)步驟: 

    1、室溫下可直接注射。若是置于冰盒上的針筒,回到室溫后,待液化再進行注射。含A膠與C緩沖溶液的細 胞混合液的針筒,以皮下注射方式,注射實驗所需的體積至實驗鼠 (建議皮下注射量為 0.2 mL,實際狀況 依需求而定)。(針筒放冰上注射阻力會上升, 放室溫會液化注射阻力小。注射時若因凝膠緣故而阻力變大, 需緩慢注射避免針頭噴落) 

    注1 : 注射體積可依不同實驗目的做調整,若為皮下血管生成研究注射體積需至少0.5 mL以上。 

    注2 : 若為血管生成實驗,建議在實驗鼠血管豐富的部位進行注射。 

    注3 : 此步驟依實驗需求可執(zhí)行或不執(zhí)行,若需呈現(xiàn)明顯的皮下注射隆起效果,可調整2.試劑制備將C緩沖 溶液 (10 X) 稀釋15倍,變成C緩沖溶液 (0.66 X),再執(zhí)行后續(xù)成膠實驗;提高C濃度,可提高膠體硬度。

    2、培養(yǎng)一至三周后觀察量測接種的腫瘤尺寸。 

    注 4 : 若為血管生成研究,應注射含 VEGF 及 heparin 的 A 膠,以促進血管生成。約三天后,可摘取含有 新血管生成的腫瘤組織。

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