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免疫熒光抗體法
發(fā)布時間： 2023-01-05 點擊次數(shù)： 799次原理
用人結(jié)腸癌細胞為免疫原，免疫小鼠，制得鼠抗人結(jié)腸癌細胞表面抗原（Ag）的單克隆抗體 IgG（第一抗體），二者可以發(fā)生特異性的抗原抗體反應，形成抗原抗體復合物，再加入市售（也可自制）的熒光標記的羊抗鼠IgG抗體（第二抗體），可以與復合物進一步發(fā)生抗原抗體反應（二次抗體反應），這樣就可以在光顯微鏡下觀察到這種抗原在結(jié)腸癌細胞表面的存在。材料與儀器
HeLa細胞
1640培養(yǎng)液 小牛血清 甲醛固定液 PBS 液體石蠟
蓋片 載片 培養(yǎng)瓶 培養(yǎng)皿 濾紙 鑷子 吸管 倒置顯微鏡 熒光顯微鏡 微量加樣器步驟
1. 將培養(yǎng)瓶中的結(jié)腸癌細胞接種到裝有蓋片的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2~3天。
2. 在倒置鏡下觀察到蓋片上的細胞生長狀態(tài)良好后，在蓋片左上角用玻璃筆做一下標記，以免在以后的操作中正反面顛倒。
3. 將蓋片放在甲醛固定液中，4℃固定5~10分鐘。
4. 用PBS洗三次，注意不要將PBS液直接倒在蓋片的細胞面，以免引起細胞大量丟失。用濾紙片將蓋片上的PBS輕輕吸干，不要損傷細胞層。
5. 將已稀釋好的小鼠抗體滴在蓋片上．每個蓋片50 ul，37℃溫育30分鐘。
6. 用PBS洗三次，濾紙吸干。
7. 將已稀釋好的熒光標記羊抗鼠二次抗體5ul滴加在蓋片上，37℃溫育30分鐘。
8. 用PBS洗三次，濾紙吸干。9. 將載片上滴一滴液體石蠟。然后將蓋片細胞面朝下放到載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察。
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