內(nèi)皮細(xì)胞的分離

1. 用鋁箔覆蓋軟木板。

2. 將棉紙鋪在鋁箔上面，然后用 70 % 乙醇浸泡。

3. 擠出臍帶中的血液。

4. 切除臍帶一端 2 cm 或 2 cm 以上，包括動(dòng)脈夾痕跡處。

5. 將 Luer 接合管外套插入靜脈。

6. 用針將臍帶釘在軟木板上，但注意勿穿經(jīng)血管腔。

7. 用手術(shù)刀和手術(shù)鑷剝出一段靜脈，長(zhǎng)約 2 cm。

8. 縫線固定接合管，緊緊打結(jié)兩次。

9. 夾閉臍帶另一端，將 20 ml 注射器接在接合管上，再將 25 ml D-PBSA （放在冰上）注入臍帶。靠 D-PBSA 的壓力將靜脈擴(kuò)張。檢査臍帶是否有小孔。如有小孔，用鱷魚夾夾持臍帶，使小孔閉合，但不要夾閉靜脈。

10. 將 D-PBSA 自臍帶排人廢液瓶。

11. 切除臍帶另一端，插入接合管，如步驟 8 縫線固定。

12. 用另一只注射器將 25 ml 膠原蛋白酶液（膠原蛋內(nèi)酶 H：是從溶組織梭狀芽孢桿菌提純的（1074059，Roche）。0.5 mg/ml， 用 M199 配制 25 ml）注入臍帶，直至臍帶膨脹。

13. 用乙醇噴過的塑料薄膜將臍帶包裹，在 37°C 條件下放置 8 min。

14. 將膠原蛋白酶液擠出臍帶，同時(shí)回抽注射器。

15. 拔出注射器，將膠原蛋白酶液注入含有 5 ml NBS（冷的新生小牛血清，5 ml） 的試管。

16. 在臍帶另一端換注射器，將 25 ml D-PBSA 注入臍帶。

17. 擠壓或拍打整段臍帶一會(huì)兒，然后用此端的注射器抽取 D-PBSA。

18. 將抽取的 D-PBSA 注入在步驟 15 使用的試管。

19. 在 4°C  條件下離心（210 g，10 min）。

20. 用 5 ml HUVFC 生長(zhǎng)培養(yǎng)液混懸細(xì)胞。

21. 吸去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)多余的明膠溶液，接種細(xì)胞。

22. 第 2 天從培養(yǎng)瓶吸去培養(yǎng)液。

23. 用 D-PBSA 洗兩次，然后加入 HUVEC 生長(zhǎng)培養(yǎng)液（M 199 培養(yǎng)液，添加 Hank 鹽、2 mmol/L 谷氨酰胺、25 mmol/L HEPES、20% FBS、150 U/ml 青霉素和鏈霉素混合液以及從牛腦提純的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑（endothelial cell growth supplement，ECGS）。使用 Roche 公司生產(chǎn)的 EGGS （1033484，75 mg）時(shí)，25 μg/ml，并用 5 μg/ml 肝素，也可使用 Sigma 公司的產(chǎn)品（E2759，15 mg），30 μg/ml，并用 10 μg/ml 肝素）。

維持培養(yǎng)

24. 吸去一半培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液，每周 3 次。

25. 大約每周傳代一次。將胰蛋白酶和 EDTA 混合液加入培養(yǎng)瓶，收集細(xì)胞，然后按 1 : 2 傳代。

26. 不要使用超過 6 代的細(xì)胞。