一、TRIzol法提取RNA的原理

Trizol是一種廣泛適用于多種樣品總RNA提取的試劑，例如人、動(dòng)物、植物和細(xì)菌、血液等。一般提取的總RNA沒有DNA和蛋白質(zhì)污染，常用于RT-qPCR、mRNA純化等實(shí)驗(yàn)。

廣譜型Trizol含有異硫氰酸胍/酚，具有裂解能力，可在短時(shí)間內(nèi)裂解細(xì)胞和組織樣本并有效抑制RNase酶活性從而保證RNA的完整性。其原理是Trizol中異硫氰酸胍、苯酚等不可逆地使蛋白質(zhì)和RNase變性。隨后進(jìn)行離心。在酸性條件下，總RNA保留在上層水相中，而大部分DNA和蛋白質(zhì)保留在中間相或下層有機(jī)相中。然后通過(guò)用異丙醇沉淀回收總RNA。

在這個(gè)過(guò)程中，可利用吡咯碳酸二乙酯(DEPC)可滅活RNase酶，75%的酒精洗滌RNA沉淀，去除蛋白質(zhì)，相關(guān)有機(jī)物的污染；最后用無(wú)核酶水溶解白色沉淀得到所需RNA。值得注意的是TRizol有毒，需在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，做好自我防護(hù)??！

圖2. 6cm培養(yǎng)皿

（1）對(duì)于細(xì)胞鋪板：一般情況下我會(huì)收集10cm的皿4個(gè)或者5個(gè)T25培養(yǎng)瓶，一般情況下細(xì)胞生長(zhǎng)較好可能會(huì)有3000-4000萬(wàn)的細(xì)胞，多的有5000萬(wàn)（懸浮細(xì)胞）。以懸浮細(xì)胞為例，漿細(xì)胞收集至15ml離心管后，離心去上清，再用1-2ml新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，通常會(huì)用1ml重懸。根據(jù)傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)板估計(jì)細(xì)胞數(shù)目：

7、通常為了節(jié)約試劑，減少用量，0.5ml的TRIZOL足夠RNA的提取。

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