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小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）原代培養(yǎng)
發(fā)布時間： 2023-01-11 點擊次數(shù)： 1163次原理
將小鼠的胚胎成纖維細胞（MEF）從機體中取出，經胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細胞，置MEF生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖。材料與儀器
孕鼠
PBS EDTA 胰酶 MEF生長培養(yǎng)基 FBS 高糖DMEM
眼科直剪 眼科直鑷 眼科彎鑷 玻璃平皿3 尼龍濾網 離心管 手術刀片步驟
一、實驗材料準備1. 動物
孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
2. 試劑無Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生長培養(yǎng)基(高糖DMEM加10%FBS)。
3. 器械
眼科直剪3把、眼科直鑷3把、眼科彎鑷2把、玻璃平皿3套、200目尼龍濾網、50 ml和15 ml離心管和手術刀片。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理。
二、具體操作
1. 處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外一組剪刀、鑷子剪開腹部肌層，露出子宮，最后用第三組剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。2. 用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內臟，將其余胚胎轉移到一個裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS，再重復此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉移到另一裝有D-PBS的平皿中，并用手術刀片將其細細切碎。3. 用200 ul的移液槍反復、快速地吹打平皿中的液體，轉移至15 ml離心管中，于4℃ 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，放在37℃水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。4. 將上層細胞懸液倒入一個裝有10 ml MEF生長培養(yǎng)基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網過濾后，以1 500 rpm離心5分鐘收集細胞，再用30 ml MEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次。5. 細胞沉淀用15 ml MEF生長培養(yǎng)基重懸后進行細胞計數(shù)(一般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細胞)。6. 3x106細胞懸浮于15 ml MEF生長培養(yǎng)基中，接種到200 ml培養(yǎng)瓶中。7. 24小時后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基。8. 細胞長滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時間不宜過長，作者一般不超過五分鐘)，按1:5傳代。9. 細胞再次長到覆蓋率80-90%左右，將其消化后，常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配)。
小鼠胚胎成纖維細胞(MEF 100倍)
注意事項
1. 原代培養(yǎng)，一定要避免污染。
2. MEF生存能力有限，如果不凍存，體外存活十代左右。
3. 凍存后復蘇的細胞只能傳代一次，因為這些細胞繁殖能力有限。
4. 消化細胞時間不要過長。以上就是本期的內容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網站鏈接了解更多技術與產品資訊。
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