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    混合淋巴細(xì)胞增殖

    發(fā)布時(shí)間: 2023-01-11  點(diǎn)擊次數(shù): 902次

    簡介

    混合淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)也稱混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(MLC)或稱混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR),常用于器-官-移-植前的組織配型,以測定受體和供體主要組織相容性抗原(HLA 抗原)相容的程度。

    材料與儀器

    器材:細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、吸管等、CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)。
    試劑:
    ① 10%FCS-RPMI 1640 培養(yǎng)基 ;
    ② 細(xì)胞 DCs 細(xì)胞、反應(yīng)細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞。
    ③ 3 H-TdR 工作液


    步驟

    混合淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的基本過程可分為如下幾步:
    (一)刺激細(xì)胞(DCs)的制備
    A. 取健康志愿者肝素抗凝的外周血,淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞
    B. 以 10% FCS-RPMI 1640 懸浮細(xì)胞置培養(yǎng)瓶中,37℃、5% CO2 培養(yǎng) 2 小時(shí),輕輕翻過培養(yǎng)瓶,棄掉培養(yǎng)上清,將非貼壁細(xì)胞棄掉,即得貼壁的單核細(xì)胞
    C. 補(bǔ)加 10% FCS-RPMI 1640 同時(shí)加入 20 ng/ml 的 hGM-CSF,500 IU/ml 的 IL-4,培養(yǎng)至第 7 天,收集懸浮細(xì)胞,即為 DCs
    D. 刺激細(xì)胞經(jīng) 25 μg/ml 的絲-裂-霉-素 C 或 2000 rad y-射線照射處理使刺激細(xì)胞失去增殖能力。
    (二)反應(yīng)細(xì)胞的制備
    A 取健康人外周血制備單核細(xì)胞,PBS 洗 3 次后,37℃、5% CO2 貼壁 2 小時(shí),收集懸浮細(xì)胞,作為反應(yīng)細(xì)胞
    B 以 RPMI 1640 培養(yǎng)液重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度至 1x106 個(gè)/ml。
    (三)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)
    A 將刺激細(xì)胞調(diào)整濃度分別為 1x106、5x105、2x10、1x105、5x104 個(gè)/ml, 10%FCS-RPMI 1640 培養(yǎng)于 96 孔培養(yǎng)板中,每濃度設(shè)立 3 孔,100μL/孔
    B 將反應(yīng)細(xì)胞濃度按 1x106 個(gè)/ml 每孔分別加入上述各孔中,100μl/孔
    C 同時(shí)設(shè)立刺激細(xì)胞對(duì)照組(不同濃度刺激細(xì)胞 100μl+培養(yǎng)液 100μl)和反應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組(反應(yīng)細(xì)胞 100μl+培養(yǎng)液 100μl)
    D 37℃,5% CO2 培養(yǎng) 5 天后,3 H-TdR 摻入率檢測反應(yīng)細(xì)胞的增殖水平。


    注意事項(xiàng)

    1. 實(shí)驗(yàn)中注意無菌操作
    2. 如作單向混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn),則刺激細(xì)胞接受照射劑量要準(zhǔn)確,使細(xì)胞暫時(shí)存活,但失去增殖的能力。


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